1.简介
微生物污染是组织培养中普遍存在的问题。在培养基中添加杀菌剂已成为防治污染的一种重要方法。但目前研究主要集中在防治细菌污染方面，对真菌污染较少顾及。故本实验对组培过程中易污染的真菌分离与鉴定，并进行一些杀菌剂的抑菌实验，以期能找到有效降低真菌污染的方法。
2.实验材料
2.1培养基
MS基础培养基，马铃薯葡萄糖培养基。
2.2组培材料与杀菌剂
组培材料：烟草
杀菌剂：医用抗生素：制霉菌素、灰黄霉素、酮康唑。实验室常用杀菌剂：次氯酸钠。
3.实验方法
3.1污染真菌的收集与鉴定
收集：将5个MS培养基平板开盖后放置在超净工作台上，静置20min后,盖上培养皿，放入培养箱25℃下培养3～5d，形成明显的菌落以便分离鉴定。
分离与鉴定：使用马铃薯葡萄糖培养基对收集到的真菌进行化线分离,纯化培养，直至形成单菌落。通过形态学特征鉴定真菌。
3.2抑菌试验
已从鉴定的真菌中每属选取1 个代表种为材料，使用滤纸片法测定各种杀菌剂的抑菌效果。从真菌培养物中提取孢子，稀释至102cfu /ml。将孢子悬浮液以每付平板0.5ml的量加入到50℃左右的MS培养基中，混匀后倾到平板。用无菌镊子取半径0.5cm的圆形无菌滤纸片，分别浸泡在经过滤灭菌的不同浓度的制霉菌素、灰黄霉素、酮康唑(均分为200mg/L、50mg/L、10mg/L 3个浓度)及次氯酸钠溶液(分2%、0.5%、0.1%3个浓度)中1min，等距置于混有真菌孢子的培养基表面。每组设6个重复样本。于25℃培养5d后观察结果。如有抑菌作用，则滤纸片周围无菌生长，形成抑菌环。根据抑菌环大小，判断抑菌效果。
4.结果分析
4.1真菌的分离与鉴定：通过对空气中污染真菌的分离纯化，共获得9种真菌，其中曲霉属(Aspergillus) 2种，毛霉属(Mucor) 2 种，青霉属( Penicillum ) 3 种, 木霉属( Trichoderm a) 1种，根霉属(Rhizopus) 1种。这些均为常见真菌，它们的孢子在空气中分布广，含量大，易造成污染。且其在培养基上生长迅速，繁殖旺盛，较短时间内就会威胁到植物的生存。组培中需对这些真菌重点防治。
4.2不同浓度杀菌剂抑菌效果比较：高浓度次氯酸钠对这5种真菌均有很强的抑制作用，制霉菌素抑菌效果最明显，灰黄霉素的抑菌效果不理想。
4.3混合杀菌剂抑菌试验结果：用50mg/L酮康唑+50mg/L制霉菌素+ 0.1%次氯酸钠组成的混合杀菌剂，抑菌效果好，对植物伤害小，是良好的防真菌污染添加剂。