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组培知识

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组织培养中培养基的成分(四)

1.培养材料的支持物
(1) 琼脂 (agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中,成为溶胶,冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的"煮化"培养基,就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂的用量在4~10g/L之间,若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐,也会逐渐丧失凝固能力。
加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便,通气问题易于解决,便于经常观察研究等,但它也有不少缺点,如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,同时培养物排出的一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质,特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时,则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥,然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。
 (2) 其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等,总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
2.抗生物质 (antibiotic)
抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在5~20mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养,效果更好。对于刚感染的组织材料,可向培养基中注入5%~10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,可能某些植物适宜用青霉素,而另一些植物却不大适应。值得提醒的是,在工作中不能以为有了抗菌素,而放松灭菌措施。此外,在停止抗生素使用后,往往污染率显著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。
3.抗氧化物 (antioxide)
植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类,产生可见的茶色、褐色以致黑色,这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒,使培养的材料生长停顿,失去分化能力,最终变褐死亡。在木本,尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。目前还没有彻底完善的办法,只能按不同的实际情况,加用一些药物,并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法,使之有不同程度的缓解,当然像严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc,可用50~200mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面,或过滤灭菌后加入固体培
养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。