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植物脱毒与病毒检测


 
一.植物脱毒的意义
  目前病毒病已成为作物生产中仅次于真菌病害的主要病害,是造成大田作物和园艺作物的生活力、产量和品质下降,甚至造成植株大面积死亡的重要原因之一,给农业生产造成巨大的危害和损失。由于病毒复制与植物代谢密切相关,而且有些病毒的抗逆性很强,至今仍没有一种特效药物能够实现既能有效防治病毒病害,又不伤害植物。因此,通过组织培养来培育脱毒苗,无疑满足了农作物和园艺植物生产发展的迫切需要。
  脱毒苗具有以下特点: 1.提高产量;2.提高品质;3.抗病性增强。
二.脱毒方法
   植物的病毒除豆类等一部分作物外,种子均不传染病毒,而营养繁殖的植物病毒病的蔓延日益显著,几乎遍布所有这类植物。病毒的粒子极其微小,只有在电子显微镜下才能确定,防治极其困难。自50年代发现用组织培养可以脱除病毒以来,现已在生产上广泛应用。
  1.热处理脱毒
  原理:利用病毒和寄主植物耐高温性的差异,用高于常温的热空气或热水处理植物,使植物体内的病毒受热以后部分或全部钝化,而植物的组织很少或不会受到伤害。   
  方法:
  (1)温汤浸渍处理:此法简单异型,适用于休眠器官、剪下的接穗或种植材料,在50℃左右的温水中浸渍10分钟至数小时,可使一些热敏感的病毒失活,但易使材料受伤。
  (2)热空气处理:适用于鲜活植物材料的脱毒。将生长的盆栽植株、愈伤组织、离体瓶苗等移入温热治疗室内,以35-40℃的温度处理几十分钟至数月。处理温度和时间因植物种类和器官的生理状况而定。
  2.茎尖脱毒
  原理:病毒在植株体内分布并不均匀,病毒的数量因植株的年龄与部位而异,在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒。分生组织内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,病毒移动的速度远赶不上活跃生长的茎尖,所以生长点含有的病毒数量极其微少,甚至检测不出病毒。
   方法:在解剖镜下,一手用镊子夹住无菌的茎尖,一手用解剖针逐层剥去生长点周围的叶片,直到达到晶莹发亮的光滑圆顶为止,根据不同目的可取带1-2个叶原基的茎尖,接种在培养基上培养。
  3.化学疗法脱毒
  原理:许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)经注射或经培养基进入带病毒植株后,会阻止病毒RNA帽子结构的形成而达到去除病毒的目的,然后再结合茎尖培养进一步脱毒。
  4.其他脱毒方法
  4.1 愈伤培养脱毒:愈伤组织增殖速度比病毒复制速度快或产生抗病毒变异,但此法外植体选择面广,脱毒苗变异率较高,生产上较少使用。
  4.2 珠心胚培养:具有多胚性的种子(如柑桔)除了一个有性胚之外,其他的胚来源于不含病毒的珠心细胞。通过培养珠心胚,可以得到除去病毒的新生系,然后嫁接繁殖成无病毒植株。
  4.3 花药脱毒:花药培养经愈伤组织培养途径产生的花粉植株不带病毒。目前已草莓上广泛使用,脱毒率在 90% 以上 。
三、植物脱毒苗的鉴定
  1.指示植物法
  
利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准,这种对病毒敏感并能产生专一性枯斑症状的植物即为指示植物,又称鉴别寄主。症状分两种类型,一种是接种病毒后产生系统性的症状,并扩张到非接种的部位;另一种是只在接种部位产生局部病斑,根据病毒的类型而出现坏死、褪绿或环状病斑。指示植物有千日红、野生马铃薯、曼陀罗、辣椒、酸浆等。
  2.抗血清鉴定法
  植物病毒是由核酸与蛋白质组成的核蛋白,可作为一种抗原,注射到动物体内即产生抗体。抗体存在于血清之中称为抗血清。不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性,用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒,这种抗血清就成为病毒检测高度专一性的试剂,特异性高,是植物病毒鉴定最有用的方法之一。
  3.酶联免疫法
  酶联免疫吸附测定法(ELISA法)是将酶与抗体(或抗原)结合,制成酶标抗体(抗原),将抗原固定在支持物上,加入待检血清,然后加入酶标记的抗体,使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合,最后用特殊分光光度计测定。此法灵敏度高,特异性强,是抗血清鉴定法中发展最迅速、应用最广泛的方法。具体应用见植物病害诊断试剂盒
  4.其他方法
  
4.1 直接观察法
   直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状特征是一种最简便的方法。然而在寄主植物上感染病毒后出现症状需要较长时间,还有的不使寄主植物表现可见症状,因此不能快速鉴定,不能用于潜隐病毒鉴定,需要更敏感的测定方法。
  4.2 电子显微镜观察法
  用电子显微镜直接观察被鉴定植物组织的提取液有无病毒,并进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构甚至种类,但设备昂贵。
  4.3 RT-PCR检测法
  首先提取被鉴定植物的病毒RNA,根据病毒基因序列设计合成引物,反转录合成病毒cDNA,然后进行cDNA扩增,取出扩增产物,利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
  4.4 核酸斑点杂交技术
     根据互补核酸单链可以相互结合的原理,将一段核酸单链以某种方式加以标记,制成探针,与互补的待鉴定病原的核酸杂交,鉴定带探针的杂交物指示病原的存在。