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组培知识

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杀菌剂对枸杞组织培养中真菌污染的控制作用

 
  枸杞(Lycium barbarumL.),茄科,属落叶灌木,是重要的“药食同源”的功能型特产资源。枸杞耐盐碱、耐干旱、耐寒,是我国北方地区防风固沙、绿化与美化环境的优良树种,具有良好的发展前景。因此,研究枸杞的组织培养快繁技术具有现实意义。枸杞的组织培养过程中,在培养基中添加杀菌剂已成为防治污染的一种重要方法,并已得到广泛运用。但目前,该方面研究主要集中在防治细菌污染,如罗青等的研究,对真菌污染方面的研究较少。笔者通过在培养基中添加不同浓度的各种农用杀菌剂,探索出了一条控制枸杞组培快繁中真菌污染的有效途径,从而选用被污染枸杞组培苗的茎尖、基部腋芽和侧芽等为材料,培养获得再生植株,为今后枸杞的组培快繁技术提供一定科学依据与参考。
  1 真菌污染产生的原因
  1.1 培养材料污染  外植体材料带菌多,如果表面消毒不彻底,即杀菌剂使用不当或处理时间不适,未将病菌全部杀死,从而导致接种后病菌在培养基中扩大繁衍。
  1.2 操作器具带菌  操作器械、器皿(镊子、剪子、刀片、三角瓶、培养皿、超净工作台、酒精灯)等未经严格的高温灭菌,则会产生污染。另外,器械在灭菌后的取放过程中不慎带菌也会造成污染。
  1.3 培养基污染  经过灭菌的空白培养基有时也会出现污染。若菌落只存在于培养基表面,则有可能是封口不严或放置培养基环境中的病菌孢子过多所致;若有白色云雾状物质,且出现在培养基内部,则表明灭菌不彻底。另外,母液放置过久,也会造成培养基的污染。
  1.4 培养物生长环境不洁  培养物的生长环境(组培室、接种室)不卫生,如门窗封闭不严,则蚊蝇、飞蛾、虫子易进出,有利于杂菌传播。同时,室内尘埃多,经常不清扫消毒,会使菌落增多造成污染。
  1.5 接种人员带菌  接种人员对自身消毒不严或无菌操作技术不熟练,容易造成组培苗的污染。
  2 材料与方法
  2.1 材料
  2.1.1 培养物材料  枸杞继代培养中受真菌污染严重的部位,包括枸杞组培苗的茎尖、基部腋芽和侧芽等。
  2.1.2 试剂  杀菌剂为50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂、25%甲霜灵可湿性粉剂作为杀菌剂;分化培养基为MS+6-BA0.01 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂4 g/L,pH值5.8,无菌水(将蒸馏水装入三角瓶,封口,在121℃的高压灭菌锅中保持30 min,冷却后备用)。
  2.1.3 仪器。高压灭菌锅、超净工作台、分析天平。
  2.2 方法在枸杞的分化培养基中,分别加入3种杀菌剂:50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂、25%甲霜灵可湿性粉剂各1.5 g/L,对照(CK)则不加任何杀菌剂。按80 ml/瓶分装,经常规高温高压灭菌备用。再将受真菌污染的培养材料用无菌水震荡清洗3次,每次5min左右,再转接入已制备好的培养基中,每处理转接20瓶,每瓶1个污染材
料。在光照12 h/d、光强2000lx和温度23℃的条件下,培养并观察培养材料的污染及生长情况。
  3 结果与分析
  在对枸杞组织培养过程中,75%代森锰锌可湿性粉剂的污染率较低,仅10%,即抑菌率较高,达90%,对真菌污染具有显著的防治效果,枸杞的生长情况良好,这表明75%代森锰锌对培养材料的生长未构成影响,反而对其具有一定的促进作用。其次,抑菌效果较好的杀菌剂为50%多菌灵可湿性粉剂,其有较明显的抑菌效果,污染率为15%,即抑菌率为85%,成活的枸杞的生长情况较好。对照组(CK)未添加任何杀菌剂,该组的污染率达100%,培养材料全部死亡。因此,在各杀菌剂对枸杞组织培养中真菌污染的控制作用研究中,75%代森锰锌可湿性粉剂的杀菌效果最好,其次为50%多菌灵可湿性粉剂。
  4 结论与讨论
  (1)以往在枸杞继代培养中一旦出现真菌污染,就将材料丢弃,但对于较珍贵的材料会造成不可避免的浪费,笔者通过在培养基中加入3种常用的杀菌剂,对其抑菌效果进行比较,找到了一种在枸杞继代培养中既能有效防止真菌污染,又能在一定程度上促进组培苗生长发育的杀菌剂――75%代森锰锌可湿性粉剂,不仅成本低,而且污染远远小于升汞,对枸杞组培苗的生长无不良影响,对枸杞组织培养中防止真菌污染具有十分重要的意义。
  (2)在枸杞组织培养过程中,继代培养时的微生物污染,往往是真菌和细菌的混合污染或内源菌和外源菌的混合污染,情况较为复杂。因此,在培养基中添加杀菌剂抑制真菌外的同时,还应添加抗生素抑制细菌。