三色堇( Viola tricolor) 是堇菜科堇菜属多年生草本花卉，常作二年生栽培，是花坛常用花卉之一。三色堇的常规繁殖采用种子繁殖或扦插，但用种子繁殖，其后代性状易分离退化；使用扦插繁殖系数低，而组织培养以其繁殖系数大，繁殖周期短、成本较低，可周年生长等优点，弥补了常规繁殖的不足。

目前国内关于三色堇组培方面的研究鲜有报道。本项研究针对三色堇组培过程中的关键环节进行了研究，以期为三色堇的种质资源保存、新品种工厂化繁殖推广及遗传转化奠定基础。

一、材料与方法

材料：三色堇品种大花黄( B1H) ，选择生长健壮、无病虫害的植株作为试材。

方法：

1、外植体的表面消毒：以幼嫩和较老的顶芽为外植体，进行消毒方式筛选。

2、不同激素组合对顶芽生长的影响：以MS 和1/2 MS为基本培养基，分别加入不同浓度 NAA 和6-BA的培养基中培养。每个处理重复3次，每个重复接种20瓶。

3、不同激素组合对继代培养的影响：将初代培养得到的苗转接到以MS为基本培养基，分别添加不同浓度6-BA和NAA的培养基中培养，30d后统计诱导外植体分化及生长情况。

4、不同培养基对生根培养的影响：将4~5cm 的芽苗切下，接种到生根培养基上，每个处理重复3次，每个重复接种20瓶。30d后观察生根情况和生长情况。

5、培养条件：培养基中含蔗糖30g/L、琼脂 7g/L，pH 值5.8~6.0。培养条件为：温度( 23±2)℃ ，光16h，光强 2000lx。成活率(%)=萌发出叶片的外植体个数/接种外植体数×100%；增殖系数 =增殖后的侧枝数/接种的顶芽数；生根率=生根外植体数/接种外植体数×100%。

初代培养基配方：

培养基的组成( mg/L)

A1：MS+6-BA2+NAA0.1；A2：MS+6-BA2+NAA0.2；A3：MS+6-BA2+NAA 0.5；A4：1/2MS+6-BA0.2+NAA0.1；A5：MS+6-BA3+NAA0.2；A6：MS+6-BA 0.2 +NAA0.1；A7：MS+6-BA4+NAA 0.4；A8：MS+6-BA6+NAA 0.6；A9：MS+6-BA8+NAA 0.8；A10：MS+6-BA10+NAA 1.0。

继代培养基配方：

培养基的组成( mg/L)

B1：MS+6-BA2 + NAA 0.02；B2：MS+6-BA 2+NAA 0.05；B3：MS+6-BA 1+NAA 0.02 ；B4：MS+6-BA1+NAA0.05；B5：MS +6-BA3+NAA 0.03。

生根培养基配方：

培养基的组成( mg/L)

C1：1/2MS；C2：1/2MS + NAA0.01；C3：1/2MS+ NAA 0.1；C4：1/2MS+ NAA 0.5；C5：1/2MS+ IBA 0.01；C6：1/2MS+ IBA0.02；C7：1/2MS+ IBA 0.04；C8：1/4MS+ NAA 0.1；C9：1/4MS+ NAA 0.2；C10：1/4MS+ NAA 0.3。

二、结果与分析

1、不同消毒处理对外植体成活率的影响

对于幼嫩的顶芽，用酒精和升汞消毒外植体比只用升汞消毒污染率要低。70%酒精15s + 0.1% HgCl2消毒3min的污染率最高，达80% ；消毒7min，污染率虽然降低，只有20% ，但死亡率达40%；消毒5min 比较适宜，成活率最高为60%，死亡率最低。对于较老的顶芽来说，用酒精和升汞消毒外植体也比只用升汞消毒污染率明显降低。70% 酒精 15s+0.1% HgCl2消毒10 min的效果较好，死亡率低，成活率较高为50% 。

2、不同激素组合对顶芽生长的影响

最佳的初代培养基为A2: MS + 6-BA 2mg/L + NAA 0.2mg/L。接入A2培养基后，顶芽生长很快。14 d 后从原来的1.5cm长高到4~5cm，生长比较健壮，顶部的叶片随之长大，不断有新叶长出。而且A2的成活率最高，达 72%，A4 的成活率也比较高，达68% ，不过生长速度较慢。A1、A3、A5、A6 长势一般，生长缓慢。A7~A10 的效果一样，顶芽长势不明显。

3、不同激素组合对增殖培养的影响

最佳继代培养基为 B1：MS+6-BA1 mg/L + NAA0.02 mg/L，增殖系数为 3.3。将初代培养的顶芽切下接入继代培养基，大约10d 后分化出侧枝。侧枝生长很快，10d 侧枝能长高 2cm，30d后就能长满整个三角瓶。

4、不同培养基对生根培养的影响

最好的生根培养基是 C3:1/2MS + NAA 0.1mg/L，生根数较多，且根较粗壮。从试验过程来看，三色堇生根较困难，需要时间较长，至少30d才能看到少许根长出。

三、讨论

为使组织培养获得成功，必须选择适宜的外植体，应考虑接种材料的来源、器官或组织的类型、外植体的大小、生理年龄等。对多数一、二年生草花来说，以幼嫩的组织和器官最好。本研究的结果显示，三色堇幼嫩的顶芽是比较容易组培成功的外植体。有研究表明，细胞分裂素与生长素的比值影响着芽的诱导，其比值偏高时能显著诱导芽的分化，反之则能明显促进根的生长。本研究发现，适当浓度的6-BA 和 NAA 组合对顶芽的生长起着关键作用，6-BA 浓度为 2.0 mg/L，NAA 浓度为0.2 mg/L的 MS 培养基对三色堇顶芽的生长起到促进作用，在此培养基上芽生长健壮。在增殖培养中，三色堇以MS + 6-BA 1mg/L + NAA0.02 mg/L培养基最好，三色堇的增殖方式属于丛生芽增殖型，属于定芽成苗，遗传比较稳定，很少发生变异。