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组培知识

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植物组织培养技术之培养基的制备

(一)母液的配制与保存
  在组织培养数量大,特别是工厂化生产时,为了操作方便,一般先配成高于所需浓度10倍或100倍的母液,用时再稀释10倍或100倍。
  母液配制时注意不能产生沉淀,易沉淀的化合物主要是磷酸钙。另外,硫酸钙和磷酸锰也较易产生沉淀,产生沉淀后一般不可逆转,导致所配溶液不能使用。因此,在配制母液时要避免Ca2+和PO43-、Mn2+和PO43-、Ca2+和SO42-在高浓度下相遇。在混合时要有先后次序,把易产生沉淀的试剂错开,并且一定要在较稀的浓度下混合,混合时要充分搅拌。例如配MS大量元素时有5种试剂,包括KNO3、NH4NO3、MgSO4.2H2O、KH2PO4和CaCl.2H2O。将这5种组分分别用5个烧杯单独溶解,先把前4种加在一起不会产生沉淀,而后加水到将近900ml时再将溶解后的CaCl.2H2O溶液近100ml倒入,定容至1000ml,这样配制不会产生沉淀。
  铁盐必须单独配制,因为铁盐与其他母液混合后易产生沉淀。早期的培养基多采用硫酸亚铁、柠檬酸铁、酒石酸铁和氯化铁等,这些溶液在PH值高于5.2时易形成Fe(OH)3沉淀,不易被植物吸收。现在多采用螯合铁,即把硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠分别溶解后加热混合产生螯合物NaFe-EDTA,不会产生沉淀,易被植物吸收。
  有机成分一般也可配成浓缩100倍的母液。在工厂化生产时,几个有机成分可以混合在一起。但如果生产量较少,有机物最好单独配置,因为几种有机成分混在一起后,浓度较高容易发生霉变。
(二)植物生长调节物质的配置和保存
  组织培养中常用的植物生长调节物质一般都不能直接溶解于水,其配法也有不同。IAA、IBA、NAA、和GA3可先用少量95%酒精溶解,再用温蒸馏水定容;2,4-D可用少许1mol/LNaOH溶解,再加温水定容;6-BA和KT等细胞分裂素可先溶解于少量1mol/L HCL中,再用热蒸馏水定容,如果未溶解好,可将小烧杯放入水浴锅中慢慢加温,轻轻摇动即可溶解。
  生长调节物质的配置浓度可以以1mg/ml为单位,例如称取50mg6-BA,溶解于50ml的蒸馏水中,其浓度为1mg/ml;若取1ml加到1L培养基中,其浓度为1mg/L。配好后装入棕色试剂瓶中,贴上标签,存放在药品保存箱中备用。
  植物生长调节物质价格一般比较昂贵,易氧化变质,配制时不宜一次配的过多或浓度太高,一般配制在1个月内能使用完的量,并保存在低温黑暗处。
(三)培养基的配置程序
  培养基中的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、生长调节物质以及蔗糖和琼脂粉都分别配备好后,才可配制培养基。
  培养基制作过程中有几个细节问题需要注意:
  第一,煮培养基所用的容器应自制容量刻度标志。
  第二,琼脂最好现在蒸馏水中浸泡1小时,加热融化后,再加入培养基的其它成分,最后加蔗糖,蔗糖溶解后搅拌均匀及定容,并调节pH值。
  第三,调pH值时,使用1mol/LNaOH(40g NaOH溶解到1L水中)和1mol/LHCL84ml加水定容到1L),多数培养基偏酸,要用NaOH 调节pH值,用酸度计或精密pH试纸测定。通常高压灭菌后酸度会增加0.2左右,在调pH值时应予考虑。
  第四,分装时不要将培养基粘在瓶口或瓶壁上,以免引起污染或不便观察。
  第五,培养基配好后要立即高压灭菌,不能过夜,如果当天消毒不完,应放入冰箱过夜后消毒。